PCR (полимераза верижна реакција). Како е PCR дијагноза, упатства, како да се подготват за проучување, PCR резултати

За соодветен и ефикасен третман на многу заразни болести мора да биде навремено да се воспостави точна дијагноза. Во решавањето на овој проблем денес се вклучени високо-технолошки дијагностички методи врз основа на методи на молекуларната биологија. Во моментов, на полимераза верижна реакција (PCR) е веќе широко се користат во медицинската пракса како најсигурен инструмент за лабораториска дијагноза.

На што се должи популарноста на PCR во моментот?

Прво, овој метод се користи за откривање на патогени на разни заразни болести со висока точност.

Второ, за следење на ефикасноста на третманот.

Во разни прирачници, брошури, статии и објаснувања на медицинските специјалисти, ние често се соочуваат со употреба на нејасни термини и зборови. Навистина е тешко да се зборува за високо-технолошки производи наука вообичаени зборови.

Што е дијагностичка PCR суштината и механика?

Секој жив организам има свои уникатни гени. Гените се наредени во ДНК молекул, кој всушност е "картичка" на секоја специфична организмот. ДНК (генетскиот материјал) - многу долго молекула која се состои од "тули" наречени нуклеотиди. Секој exciter лежат строго одредени заразни болести, на пример во одредена секвенца и комбинација. Кога тоа е неопходно да се разбере дали лицето има дадено патоген, се качува биолошки материјал (крв, урина, плунка, брис), кој се состои од ДНК или ДНК фрагменти микроб. Но, износот на генетскиот материјал на патогенот е многу мал, а тоа е невозможно да се каже она што го поседува токму на микроорганизми. За да се реши овој проблем и да служи како PCR. Суштината на полимераза верижна реакција е дека мала количина на материјал се зема за истрагата, кој што содржи ДНК, и процесот PCR е зголемување на бројот на генетски материјал кои припаѓаат на одредена патоген и на тој начин, може да се идентификува.

PCR дијагностика - генетско истражување на biomaterial.

Идејата PCR припаѓа на американскиот научник K.Mullins, кој тој го предложи во 1983 година. Сепак, широката клиничка употреба има добиено само во средината на 90-тите XXveka.

Ние ќе ја разберат ни терминологијата дека тоа е - ДНК, итн Секоја клетка на секое живо суштество (животно, растение, човечки, бактерии, вируси) има хромозом. Хромозомите - чувари на овој генетски информации, кои се состојат од целата низа на гените на секој поединец дневна работа.

Секој хромозом е составен од два ДНК нишки, искривени во спирала во однос на едни со други. ДНК - деоксирибонуклеинска киселина е хемиски, кои се состојат од структурните компоненти - нуклеотиди. 5 е нуклеотидната видови - тимин (Т), аденозин (A), гванин (G), цитозин (C) и урацил (U). Нуклеотиди се поставени еден позади друг во строга низа на индивидуални формирање на гени. Еден ген може да се состои од 20-200 нуклеотиди такви. На пример, кодирање за производство на инсулин генот, се состои од 60 БП.

Нуклеотиди се сопственост на комплементарност. Ова значи дека спротивно на аденин (А) во едната верига на ДНК потребно е тимин (Т) на другиот синџир, и обратно, гванин (G) - цитозин (C). Шематски како што следува:
D - D
T - A
A - T
Ова копче сопственост на комплементарност за PCR.

Покрај од ДНК истата структура е RNA - рибонуклеинска киселина, која се разликува од ДНК со тоа, што, наместо на тимин, урацил се користи во него. РНК - генетски информации е чувар на некои вируси, наречен ретровируси (како што се ХИВ).

       ДНК и РНК молекули може да биде "се размножуваат" (ова својство се користи за PCR). Ова се случува како што следува: на две нишки од ДНК или РНК, се одалечи од друга страна, секој конец добива посебен ензим кој синтетизира нов ланец. Синтеза е принципот на комплементарност, односно, ако во оригиналната ДНК синџирот на вредност од нуклеотидни А, потоа новосинтетизираните ќе биде T, ако Т - тогаш C, итн Овој посебен ензим "градител" има потреба од "семе" за почеток на синтезата - редоследот на нуклеотидите 5-15. Овој "семе" е дефиниран за секој ген (ген кламидија, микоплазма, вируси) експериментално.

Така секој циклус PCR се состои од три чекори. На првиот чекор се јавува т.н. релаксирање на ДНК - тоа е меѓусебно поврзани поделба на ДНК две насоки. Во вториот - е врска "семе" на местото на ДНК нишки. Конечно, насоки за продолжување на податоци на ДНК, која е направена fermentom- "градител". Во моментов овој комплексен процес се случува во една цевка и се состои од повторувачки циклуси на репродукција што е дефинирано ДНК за да се произведе голем број на копии кои може подоцна да се открие од страна на конвенционални методи. Тоа е една од ДНК се добие стотици или илјадници.

Фази на PCR студии

Земање на примероци од биолошки материјал за истражување

Како примерокот е различни биолошки материјал, крв и неговите компоненти, урина, плунка, мукозни секрети, цереброспиналната течност, секрети од рана површини, содржината на телесни шуплини. Сите bioassays собрани еднократна инструменти и бирани материјал затворен во стерилна пластична цевка или ставени врз културата медиум со следните превоз до лабораторијата.

На откриена примерокот се додава потребните реагенси и се стави во програмабилни термостат - thermocycler (термички колоездач). На thermocycler PCR повторува 30-50 пати на циклус се состои од три фази (денатурација, annealing и издолжување). Што значи ова? Размислете за детали.

Фази злоупотребат PCR реакција, копирање на генетски материјал

јас фаза PCR - Подготовка за копирање на генетскиот материјал.
Се случува на температура од 95 ° C, ДНК нишки се одделуваат, и тие може да седат "таблица".

"Буквари" се произведени од страна на индустриски методи различни научни и индустриски асоцијации и лаборатории купат готови. "Семето" да се идентификуваат, како што се кламидија, работи само за кламидија, итн Така, ако biomaterial се тестира за присуство на хламидијална инфекција, а потоа на реакционата смеса се става "семе" за hlamidiy- ако тестирање biomaterial на вирусот на Epstein-Barr, и "семе" за вирусот на Epstein-Barr.

II фаза - соединување на генетскиот материјал на инфективен агенс и "семе."
Ако има е ДНК што е дефинирано од страна на вирус или бактерии, "семе" се наоѓа на ДНК. Процесот на приклучување "семе" е втората фаза на PCR. Овој чекор се одвива на температура од 75 ° C.

III фаза - копија од генетскиот материјал на инфективен агенс.
Овој процес всушност издолжување или размножување на генетскиот материјал, кој се јавува на 72 ° C. Со "семе" е погоден ензим "градител" и синтетизира нова нишка од ДНК. Со крајот на синтеза на нова краја ДНК синџир и циклус PCR. Тоа е, еден број PCR циклус се зголемува генетски материјал двапати. На пример, во оригиналниот примерок имаше 100 DNA молекулите на било кој вирус, по првиот циклус PCR во примерокот ќе биде DNA молекулите за 200 тест вирусот. А циклус трае 2-3 минути.

За формирање на доволна количина на генетски материјал за да се идентификуваат, извршени се обично 30-50 циклуси на PCR, која трае 2-3 часа.

Група идентификација пропагира генетски материјал

Всушност PCR завршува тука и понатаму има не помалку значајна фаза на идентификација. За идентификација со користење на методот електрофореза или етикетирани како "таблица". При користење на електрофореза добиени ДНК нишки се одделени со големина, и присуството на ДНК фрагменти со различна должина укажува на позитивен резултат на анализа (т.е., присуството на вирус, бактерија, итн). Кога се користи со ознака "семе" се додава chromogen (боја) до производ финалето реакција, при што на ензимската реакција е придружена од страна на формирање на боја. Боја развој е директен доказ дека вирусот или други забележливи агент се присутни во оригинален примерок.

До денес, со користење на ознака "буквар", како и соодветен софтвер, тоа е можно да се произведе одеднаш и да се "чита" на резултатите од PCR. Тоа е толку nazyvaemayareal работно време PCR.

Зошто PCR дијагностика има оваа вредност?

Една од значајните предности на методот PCR е висока чувствителност од - 95 до 100%. Сепак, овие придобивки треба да биде врз основа на секогаш ги исполнува следниве услови:

1. точни земање мостри, транспорт на биолошки материјал;
2. достапноста на стерилен, за еднократна инструменти, специјализирани лаборатории и обучен персонал;
3. доследност стерилни техники и за време на анализата

Чувствителност варира за различни бактерии откриени. На пример, чувствителноста на PCR метод за откривање на вирус на хепатит C е 97-98%, на чувствителност за откривање на Ureaplasma - 99-100%.

Можностите кои произлегуваат од PCR анализа, може да се постигне неверојатен аналитичка специфичност. Ова значи идентификација на микроорганизмот е дека гледа, а не слични или тесно поврзани.
Дијагностичката сензитивност и специфичност на методот PCR, често ги надминуваат оние за методот на културата, наречен "златен стандард" за откривање на заразни болести. Со оглед на времетраењето на растечката култура (од неколку дена до неколку недели), предноста на PCR е очигледен.

PCR во дијагнозата на инфекции
Предностите на методот на PCR (сензитивност и специфичност) се дефинира широк спектар на апликации во модерната медицина.
Главната примена на PCR дијагностика:

1. Дијагноза на акутна и хронична заразни болести на различни локализација
2. следење на ефикасноста на терапијата
3. расчистување на видот на патогенот

PCR се користи во акушерство, гинекологија и неонатологија и педијатрија, урологија, венерологија, Нефрологија, инфективна клиника болест, офталмологија, неврологија, Phthisiopneumology et al.

Користење на PCR Дијагностицирањето се изведува во соработка со други истражувачки методи (ELISA, ПИФ, fif et al.). Нивната комбинација и ги утврдува соодветноста на присутните лекар.

инфективни агенси откриени од страна на метод PCR

вируси:

1. Ретровирусите ХИВ-1 и ХИВ-2
2. херпетиформис вируси
3. видови херпес симплекс вирус 1 и 2
4. цитомегаловирус
5. Epstein-Barr вирусот
6. Варичела - зостер вирус
7. хуманиот херпес вируси 6 и 7
8. хепатитис Ц, Б и А
9. вируси, хуман папилома
10. рубеола вирусот
11. аденовируси
12. риновируси
13. парвовирус
14. pikornovirusy

бактерии:

1. микобактерии
2. кламидија
3. микоплазма
4. салмонела
5. легионела
6. клостридии
7. бледо Treponema
8. Разни видови на патогени E. coli
9. Vibrio cholerae
10. рикеција
11. aurococcus
12.  предизвикувачкиот агенс на бактериски менингитис
13. Helicobacter pylori
14. Ureaplasma
15. гонореја
16. дифтерија Bacillus
17. Haemophilus influenzae

Во оваа листа се најчестите инфективни агенси се детектира со PCR. Всушност, оваа листа е многу поширока, постојано се ажурираат, како синтетизираат нови "потомство". Исто така треба да се напомене дека на листата на идентификуваните патогени се утврдува со присуството на "семе" за идентификација во арсеналот на секој поединец лабораторија.


Автор: AK Nasedkina